La mobilitazione
Il Reggimento mobilitò, per la guerra, 13 Battaglioni ferrovieri (di lavoro) con relative Compagnie di ponti metallici scomponibili e tre gruppi esercizio linee, con 5 sezioni esercizio. Otto Battaglioni mobilitati furono impiegati per l'ampliamento di stazioni ferroviarie del territorio nazionale, su progetto delle F.S. e svolsero un'attività estremamente intensa. Per darne un'idea basti pensare che uno solo di tali Battaglioni, nei primi mesi della campagna di Grecia (fine 1940), costruì 42 chilometri di binario normale e 2000 metri di piano caricatore.
A differenza degli altri Reggimenti dell'Arma, che si trasformarono in comando di deposito, con sole funzioni amministrative, il Reggimento ferrovieri assunse la denominazione di "Comando delle Truppe Mobilitate" e, dopo il 1943, divenne "Ispettorato delle Truppe ferrovieri", alle dipendenze del Comando supremo, tramite l'Ispettorato dell'Arma del Genio.
Comandante delle Truppe ferrovieri fu il Colonnello Giuseppe Perotti che, promosso al grado di Generale, ricoprì l'incarico di Ispettore delle stesse truppe.

Fronte occidentale
Sul Fronte occidentale operarono la 1ª, 2ª, 3ª e 19ª Compagnia ferrovieri, una Sezione militare esercizio e la 18ª Compagnia ponti metallici scomponibili. Tali unità furono impiegate nel riadattamento delle comunicazioni ferroviarie e stradali, costruendo, tra l'altro, 228 metri di ponte ferroviario e 217 metri di ponti metallici per strada ordinaria. Per le pile che si resero necessarie, fu impiegato il materiale da ponte metallico stradale n. 3 (Hebert), all'epoca in dotazione ai reparti pontieri. Le linee ferroviarie ripristinate furono la Ventimiglia - Nizza, la Cuneo - Ventimiglia e la Breglio - Nizza.

Fronte greco - albanese
L'opera più significativa realizzata nella campagna di Grecia fu la costruzione di un ponte stradale e ferroviario, operata dalla 9ª Cp. (II Battaglione) sul canale dell'istmo di Corinto. Col ponte metallico n. 3 (Roth - Wagner) fu costruita una travata di 84 metri a sbalzo, a circa ottanta metri di altezza sopra il canale. In soli 25 giorni, con l'impiego di 400 genieri, il montaggio fu portato a termine.
Altra imponente e spettacolare realizzazione dei ferrovieri fu il viadotto del Brallo sulla linea Atene - Salonicco. In 19 giornate, con una forza media di 100 genieri, impiegando materiale Roth - Wagner, fu realizzata una travata continua di 36 metri, poggiante su due pile di 60 metri d'altezza.
Nella stessa campagna, i ferrovieri del genio operarono anche per:

il ripristino del raccordo a scartamento ridotto, a livello del mare, che superava il Canale di Corinto su un ponte di barche;

l'ampliamento dello scalo ferroviario del porto del Pireo;

la costruzione di un ponte ferroviario di 30 metri con materiale Kohl (ponte metallico n. 2) sulla linea Atene - Corinto - Patrasso.

Fronte Jugoslavo
All'inizio delle operazioni furono inviate al seguito delle grandi unità operanti, il 2° Battaglione (5ª, 16ª, 18ª Compagnie ferrovieri mobilitate), sezioni miste esercizio linee unitamente ad altri Battaglioni non inquadrati. Successivamente affluì anche l'8° Battaglione (22ª, 23ª e 24ª Compagnia). Per esigenze di impiego, un gruppo di Battaglioni fu impegnato in lavori di ripristino di particolare importanza, sotto la Direzione del Comando Truppe ferrovieri mobilitati. Con altri 3 Battaglioni (il 2°, 5° e l'8°) venne costituito il gruppo Battaglioni Slovenia - Dalmazia, poi denominato 2° Raggruppamento ferrovieri mobilitato, al quale furono aggiunte compagnie autoblindo ferroviarie e 3 Sezioni esercizio linee. Queste ultime furono impiegate per l'esercizio delle linee ferroviarie di maggiore importanza del territorio jugoslavo, con il concorso di personale civile delle ferrovie stesse e, in taluni casi, anche di personale delle nostre ferrovie dello Stato. Le linee più importanti, sotto il profilo militare, erano il tronco Postumia- Longatico - Lubiana (40 km) e quello Spalato- Meja- Fiume (450 km). L'esercizio delle linee si presentò complesso e difficile, sia per i sabotaggi dei partigiani slavi, sia per gli inconvenienti che si presentavano tra il personale preposto all'esercizio (capi stazione, capi deposito locomotive), spesso di grado non elevato, e gli Ufficiali e Sottufficiali viaggianti, che frequentemente interferivano con richieste, il cui accoglimento non era consentito dal servizio ferroviario.
Per fronteggiare piccole interruzioni di linea, in testa ed in coda ai convogli venivano posti carri chiusi blindati, con squadre di ferrovieri di pronto intervento. Nella protezione delle linee furono impiegate 5 Compagnie ferrovieri di lavoro, in aggiunta alle sezioni esercizio e ad i civili delle F.S.. Per assicurare la continuità del servizio ferroviario fu necessario inoltre disporre di un servizio continuo di sorveglianza a vista, assolto dai Reparti ferrovieri con capacità e coraggio.
Nel settore dei lavori di ripristino delle interruzioni la 16ª Compagnia fu impiegata per il ripristino di ponti, generalmente in legno, sulla linea Knin - Dracac e del tronco a scartamento ridotto Knin - Drawar ove vennero ripristinate 25 interruzioni, tra le quali quella nei pressi di Strizza, di 100 metri di lunghezza, su stilate di legno.
Ma le attività più impegnative furono quelle svolte sulla linea Postumia -Lungatico - Lubiana, interrotte da frane, sottopassaggi e tre viadotti demoliti; tra questi ultimi, il viadotto di Borownica, costituito da due ordini di 25 arcate, alto 42 metri, presentava una interruzione di oltre180 metri, oltre a danneggiamenti e lesioni dei tronchi superstiti. Il ripristino di tale interruzione fu affidato, unitamente a quello di Stampetow, a un raggruppamento di impiego (2°, 5° e 6° Battaglione). Il ponte della Borownica, realizzato su quattro campate di ponte metallico n. 3 (Roth-Wagner), per una lunghezza complessiva di oltre 220 metri, richiese l'infissione di 260 pali battuti a rifiuto, la costruzione di tre pile e l'incatenamento delle arcate del vecchio ponte, superstiti ma lesionate.
I lavori di costruzione del ponte furono ultimati in poco più di due mesi.

Fronte dell'Africa settentrionale
Nell'agosto del 1942 giunsero in Africa settentrionale i reparti mobilitati: prima la 6ª Compagnia, poi la 5ª Sezione esercizio, con elementi della 4ª Sezione esercizio ed il comando del 7° Battaglione ferrovieri. Nel settembre giunse il 3° Raggruppamento ferrovieri, che assorbì anche i reparti già presenti in Africa settentrionale, costituiti da una Compagnia esercizio ferrovieri, preposta al funzionamento delle officine, una Compagnia lavoratori civili militarizzati, con funzione di guarda linee, un reparto di 150 pontieri e due Compagnie autonome di fanteria, utilizzati per la sicurezza delle linee ferroviarie. I reparti ferrovieri furono impiegati per la costruzione della linea BirSuesi-Tobruk. Nel settore dell'esercizio, la limitata potenza dei locomotori a nafta rese necessario costituire convogli con un limitato numero di carri. Difficoltà ben maggiori furono rappresentate dagli attacchi degli Inglesi, che costrinsero ad inserire nei convogli carri attrezzati con mitragliatici controaerei.
Altra insidia fu rappresentata dalle azioni dei "commandos" inglesi provenienti sia dal mare che dal deserto. Dopo El Alamein, alcune unità rientrarono in patria mentre il 7° Battaglione fu impegnato nella distruzione degli impianti e del materiale rotabile, in sabotaggi e interruzioni varie, nonché nella realizzazione di opere difensive ed infine, direttamente, nel combattimento.

Fronte Russo
Nel 1942 il 10° Battaglione ferrovieri partecipò alle operazioni sul fronte russo assicurando, fra notevoli disagi, i vitali rifornimenti alle truppe combattenti mediante il ripristino di ponti e tronchi ferroviari di preminente importanza strategica. Durante la battaglia del Don, i genieri del 10° Battaglione ferrovieri si distinsero in modo particolare nella difesa di una difficile posizione a loro affidata (zona di Krasnogorowa, dicembre 1942) ottenendo, per la Bandiera di guerra del Reggimento, una croce al valor militare.

Territorio nazionale
Sul territorio nazionale, oltre all'Ispettorato delle Truppe ferrovieri, affidato al Generale Perotti, operarono tre Raggruppamenti ferrovieri, costituiti in tempi diversi ed impiegati in territori diversi, a seconda della situazione operativa.
Inizialmente il 1° e 3° Raggruppamento furono dislocati nel territorio nazionale mentre il 2° fu impiegato in Slovenia- Dalmazia.
Al comando del 3° Raggruppamento, reduce dell'Africa Settentrionale e dislocato a Castel Maggiore (Bologna), fu affidato l'impiego dei reparti ferrovieri sul territorio nazionale a nord di Roma (territori occupati e la Sardegna) oltre al controllo tecnico della rete nazionale dell'Italia settentrionale e centrale. Il raggruppamento era costituito da 7 Battaglioni ferrovieri di lavoro, un Battaglione ponti metallici scomponibili per strade ordinarie, un gruppo sezioni militari esercizio e un Battaglione germanico. Il Comando del 2° Raggruppamento fu dislocato nell'Italia centro-meridionale. In Sicilia, dall'estate del 1941 sino a quella del 1943, furono impiegati due Battaglioni: il 3° a Trapani e il 6° a Catania. Con questi due Battaglioni, una volta ripiegati dall'isola, venne costituito, in Calabria, il 1° Raggruppamento ferrovieri. In Sicilia i due Battaglioni svolsero un'attività febbrile di ripristino delle linee continuamente colpite da attacchi aerei, soprattutto negli ultimi sei mesi.
A partire dal 1943 l'azione dell'offesa aerea interessò progressivamente tutto il territorio nazionale; l'attività dei Raggruppamenti ferrovieri divenne pertanto sempre più intensa e difficile. Non appena, infatti, la ricognizione aerea segnalava l'avvenuto ripristino delle linee ferroviarie e la ripresa del traffico, nuove ondate di bombardieri tornavano sui vecchi obiettivi, effettuando nuove distruzioni ed interruzioni. Gli impianti ferroviari più colpiti dall'offesa alleata furono quelli di Milano, Bologna, Livorno e Pisa. Con l'8 settembre del 1943 ebbe termine l'esercizio della linea Chivasso - Aosta.

Guerra di liberazione
All'atto dell'armistizio, i reparti ferrovieri dettero un chiaro esempio di saldezza morale e di attaccamento al dovere: non subirono sbandamenti e si mantennero in condizioni di prontezza di impiego.
Il 1° Raggruppamento, proveniente dalla Calabria, rinforzato dal 1° e dal 13° Battaglione ferrovieri, già operanti sul versante adriatico, fu impiegato dagli alleati nella guerra di liberazione (1943-1945) per il ripristino dei ponti. Fra questi è degno di nota il ponte Roth - Wagner su due campate, ciascuna di 63 metri, costruito sul fiume Volturno, che contribuì ad assicurare il regolare afflusso dei rifornimenti alle truppe di linea.
Ampliato negli organici, con la costituzione del 2°, 3° e 6° Battaglione ferrovieri, tale Raggruppamento, articolato ora su due gruppi di Battaglioni operanti l'uno sul fronte tirrenico (6° e 13° Battaglione) l'altro sul fronte adriatico (1°, 2° e 3° Battaglione) operò fino al termine della guerra e fu altamente apprezzato dal Comando alleato.